我們的piggyBac shRNA干擾載體系統(tǒng)是一種可穩(wěn)定干擾多種細(xì)胞類型靶基因表達(dá)的簡(jiǎn)單而有效的方法。這種基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)）將shRNA表達(dá)盒永久地整合到宿主細(xì)胞基因組中，由人類U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的shRNA將會(huì)導(dǎo)致靶基因mRNA的降解。與合成siRNA相比，piggyBac shRNA干擾具有明顯的優(yōu)勢(shì)（見(jiàn)下文載體優(yōu)勢(shì)）。

PiggyBac shRNA干擾載體系統(tǒng)包含兩個(gè)載體，一個(gè)載體被稱為輔助質(zhì)粒，負(fù)責(zé)編碼轉(zhuǎn)座酶；另一個(gè)載體被稱為轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒，包含兩個(gè)末端重復(fù)序列（TRs）以及兩者之間的被轉(zhuǎn)座區(qū)域，shRNA表達(dá)盒就克隆在這個(gè)區(qū)域。

當(dāng)輔助質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞時(shí)，輔助質(zhì)粒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶將會(huì)識(shí)別轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)TR元件，然后將被轉(zhuǎn)座區(qū)和兩個(gè)TR元件插入到宿主基因組中。轉(zhuǎn)座插入通常發(fā)生在包含TTAA序列的宿主染色體位點(diǎn)，并在轉(zhuǎn)座子兩側(cè)出現(xiàn)TTAA重復(fù)序列。PiggyBac屬于II類轉(zhuǎn)座子，通過(guò)“剪切—粘貼”的機(jī)制移動(dòng)，從一個(gè)地方轉(zhuǎn)座到另一個(gè)地方，而不留下序列本身（恰好相反，I類轉(zhuǎn)座子是通過(guò)“復(fù)制—粘貼”的方式移動(dòng)）。由于輔助質(zhì)粒是通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞的，故會(huì)逐漸丟失。隨著輔助質(zhì)粒的丟失，表達(dá)shRNA的轉(zhuǎn)座子在宿主基因組中變成了永久整合。當(dāng)這些宿主細(xì)胞再次被輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，整合的轉(zhuǎn)座子會(huì)再次通過(guò)“剪切—粘貼”的機(jī)制移動(dòng)。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多資料，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

我們的PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體與輔助質(zhì)粒是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，可在大腸桿菌中高拷貝復(fù)制，該載體系統(tǒng)對(duì)多種類型的靶細(xì)胞均具有高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。人類U6啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)shRNA的高水平轉(zhuǎn)錄，同時(shí)，我們經(jīng)過(guò)優(yōu)化的shRNA莖-環(huán)序列可高效形成有效的干擾RNA。

永久性整合和干擾：常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染只能實(shí)現(xiàn)外源基因的瞬時(shí)表達(dá)，這種外源基因會(huì)隨著宿主細(xì)胞的分裂而不斷丟失，在快速分裂的細(xì)胞中顯得尤為顯著。相反，將PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體和輔助質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，由于轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座酶的作用下，轉(zhuǎn)座子上的DNA序列能穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的染色體中。因此，U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)shRNA的組成型表達(dá)對(duì)靶基因的干擾是穩(wěn)定和永久的，這對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)來(lái)說(shuō)可能是一個(gè)重要的優(yōu)勢(shì)。如可對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞或活體干擾表型進(jìn)行長(zhǎng)期分析，有助于分離具有不同干擾水平和/或不同表型的克??；當(dāng)干擾載體攜帶熒光標(biāo)記如EGFP時(shí)，可通過(guò)流式分選具有不同熒光強(qiáng)度（熒光強(qiáng)度和整合數(shù)量有關(guān)，進(jìn)而與干擾程度有關(guān)）的細(xì)胞。

可逆性：如果再次使用輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染攜帶PiggyBac shRNA轉(zhuǎn)座子的細(xì)胞，可將表達(dá)shRNA的轉(zhuǎn)座子從某些細(xì)胞的基因組中切除，而不留下任何痕跡。但是，這種情況只發(fā)生在一小部分細(xì)胞中。

技術(shù)簡(jiǎn)單：通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)染即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，相比起病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過(guò)程更簡(jiǎn)單。

安全性：常規(guī)轉(zhuǎn)染不會(huì)引起與病毒載體相關(guān)的安全性問(wèn)題。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型受限：PiggyBac載體進(jìn)入細(xì)胞依賴于轉(zhuǎn)染。不同類型的細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率差異非常大。非分裂細(xì)胞通常比分裂細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，原代細(xì)胞比永生化細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，一些重要的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)染難度更大，如神經(jīng)元和胰島β細(xì)胞。另外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染主要局限于體外應(yīng)用，很少應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（但可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型制備）。以上因素在一定程度上制約了piggyBac系統(tǒng)的應(yīng)用。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the piggyBac transpose can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.

U6 Promoter: Drives expression of the shRNA. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.

Sense, Antisense: These sequences are derived from your target sequences, and are transcribed to form the stem portion of the “hairpin” structure of the shRNA.

Loop: This optimized sequence is transcribed to form the loop portion of the shRNA “hairpin” structure.

Terminator: Terminates transcription of the shRNA.

hPGK promoter: Human phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

rBG pA: Rabbit β-globin polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream marker gene.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See description for 5’ ITR.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.